DNA 亞硫酸氫鹽修飾和純化操作步驟

修飾設計：使用 CpGenomeTMkit 使胞嘧啶轉化為尿嘧啶的步驟如下。中等溫度堿性pH 下使 DNA 變性成為單鏈形式暴露出堿基。試劑一，一種包含亞硫酸氫根的鈉鹽，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脫氨，產生一種尿嘧啶磺酸鹽中間產物。然后 DNA 在另一種鹽﹙試劑二﹚存在的條件下與一種微粒載體﹙試劑三﹚結合，并通過重復離心和在 70%的乙醇中重懸浮脫鹽。向尿嘧啶的轉化是通過在 90%的乙醇中反復堿性脫磺酸基作用和脫鹽完成的。DNA 最終在 TE 緩沖液中通過加熱從載體上洗脫下來。

第一步：試劑準備

（1）3 M NaOH 原料（用前現配）

把 1g 干 NaOH 片劑溶解在 8.3mL 水中。使用此類腐蝕性堿，注意小心謹慎和實驗操作。

（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前現配）

配制 1mL 該溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl 水，6.6μl 3M 的氫氧化鈉。

（3）溶解試劑Ⅰ（用前現配）

打開前將試劑瓶加溫至室溫。對每份待修飾的樣本，稱取 0.227g DNA 修飾試劑Ⅰ加入 0.571mL 水中。充分渦旋振蕩混合。使用該試劑時要小心謹慎，因為它對呼吸系統和皮膚有刺激性。用大約 20μl 3M NaOH 調整 pH 至 5.0，用 pH 試紙檢測 pH 值。試劑Ⅰ避

光保存以免分解。為了*效果，試劑應在配置后立即使用。

（4）溶解試劑Ⅱ

打開前將試劑瓶加溫至室溫。將 1μl β-巰基乙醇加入 20mL 去離子水中。每份待修飾的 DNA 樣本需將 750μl 該溶液加入到 1.35g DNA 修飾Ⅱ。充分混合確保完全溶解。過量的試劑可用箔紙包裹的容器、2℃-8℃、避光保存長達 6 周。

第二步：DNA 修飾程序

1、在帶有螺旋形瓶蓋的 1.5-2.0mL 的微量離心管中：將 7.0μl 3M NaOH 加入到含有1.0 μg DNA 的 100μl 水中（10ng/μl），混勻。

注意：如果樣本含有的 DNA 量不到 1.0μg，就向樣本 DNA 中加入 2 μl DNA 修飾試劑Ⅳ并加水至總體積 100μl。再加入 7.0μl 3M NaOH 并混勻。

2、50℃ DNA 孵育 10 分鐘（加熱塊或水浴）

3、加入 550 μl 新鮮配制的 DNA 修飾試劑Ⅰ并渦旋振蕩。

4、加熱塊或水浴 50℃避光孵育 4-16 小時。

第三步：初步脫鹽

1、強力渦旋振蕩懸浮 DNA 修飾Ⅲ。用 10x 的 1mL 塑料移液管槍頭來回吸排懸液以分散仍存在的凝塊。

2、向含 DNA 溶液的管中加入 5μl 充分懸浮的 DNA 修飾試劑Ⅲ。

3、加入 750μl DNA 修飾試劑Ⅱ并充分混勻。

4、室溫孵育 5-10 分鐘。

5、5000 X g 離心 10 秒使 DNA 試劑Ⅲ成顆粒狀。（應出現一種白色的小顆粒。）棄去上清。

6、加入 1.0mL 70%的乙醇，渦旋振蕩，5000 X g 離心 10 秒，棄去上清。該步驟重復進行，共 3 次。

7、將第三次上清棄去后，離心管高速離心 2 分鐘，用塑料移液管槍頭移去剩余上清。

第四步：完成 DNA 修飾（脫磺酸基作用），再次脫鹽，并洗脫。

1、 適量樣本加入 50μl 20 mM NaOH/90% EtOH 溶液。

2、 充分渦旋振蕩懸浮顆粒，再室溫孵育 5 分鐘。

3、 5000 X g 離心以移除管頂所有成分。加入 1.0mL 90%的乙醇并渦旋振蕩洗脫顆粒。再旋轉，除去上清。再次重復該步驟。

4、 第二次洗脫除去上清后，高速離心樣本 3 分鐘。

5、 用塑料移液管頭除去所有剩余上清。試管室溫晾干 10-20 分鐘（必須除去酒精氣味）。

6、 加入 TE 緩沖液。注意：加入 TE 的量取決于起始 DNA 的量和目的用途所需的加入濃度。例如，如果加入 25μl TE，基于完全恢復 1μg DNA 的zui終濃度應為 40ng/μl。

快速強力渦旋振蕩直到顆粒完全懸浮。用手輕打或輕敲內容物至管頂（但是不要離心）。

7、 50-60℃下樣本孵育 15 分鐘以洗脫 DNA。

8、 高速離心 2-3 分鐘并用塑料移液管頭轉移樣本（上清）到新管。

9、 進行 MSP 或測序，或-15～-25℃可保存達 2 個月，-80℃可保存 6 個月。避免重復融化和解凍；可分量儲存。不要將 DNA 存儲在自動除霜冰箱。3

10、 當從一管中轉移已解凍的 DNA 以備用時，避免將試劑Ⅲ轉移到 PCR 反應管中。

通常首先將管充分離心，使殘留的試劑Ⅲ固體成顆粒狀。

三、MSP

（1）引物合成

運用特別設計的針對甲基化和非甲基化序列的引物，引物由上海生物工程有限公司合成。見表1

表1 甲基化引物序列及擴增條件

（2）PCR反應條件

a 反應體系：10×PCR 緩沖液 5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，甲基化上下游引物和去甲基化上下游引物分別為 1μl，甲基化模板 DNA5μl，Taq 酶 0.25μl，加水至總體積 50μl。

b 循環條件：

程序? ? ? ?溫度? ? ? ?時間

預變性? 95℃? ? ? ? 60 sec

變性? ? ?95℃? ? ? ? 30 sec

退火? ? ?55℃? ? ? ? 30 sec

終末延伸? 72℃? ? ?60 sec

共 35 個循環

（3）PCR 產物結果判定：瓊脂糖凝膠電泳

a 甲基化陽性：甲基化特異性引物擴增出相應長度的片斷，但非甲基化特異性引物未擴增出相應長度的片斷，則判斷基因啟動子區 5’CpG 島甲基化陽性。

b 甲基化陰性：非甲基化特異性引物擴增出相應長度的片斷，但甲基化特異性引物未擴增出相應長度的片斷。則判斷基因啟動子區 5’CpG 島甲基化陰性。