糖蛋白糖基化

2024.8.09

　　已上市的蛋白藥物中，治療性糖蛋白藥物數(shù)量眾多，糖基化是最常見的蛋白翻譯后修飾。2020版《中國藥典》第一增補(bǔ)版中，正式發(fā)布9405糖蛋白的糖基化分析指導(dǎo)原則。賽默飛能為糖基化分析提供業(yè)內(nèi)最全方案，可根據(jù)糖蛋白的復(fù)雜性、與藥物安全有效的相關(guān)性以及生產(chǎn)監(jiān)控策略的總體設(shè)計(jì)等，為糖基化提供完整糖蛋白、糖肽、寡糖、單糖的全面分析。

　　一級結(jié)構(gòu)分析：糖型分析

　　糖基化對蛋白藥物的療效、穩(wěn)定性、免疫原性具有重要的影響。以單克隆抗體為例，如果出現(xiàn)N-糖型以外的糖型，則會影響免疫原性或半衰期，需要避免；另一方面，可以細(xì)胞工程及分子生物學(xué)技術(shù)，提高一些N-糖型的含量，以增強(qiáng)ADCC、CDC、Anti-inflammatory等效能。寡糖為非模板合成，并呈樹狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，僅由6種單糖組成的寡糖鏈，其理論結(jié)構(gòu)即達(dá)到驚人的1012種。這就要求用于寡糖的分析設(shè)備具有強(qiáng)悍的分析性能。賽默飛開發(fā)了一系列簡單、高效的液相色譜-質(zhì)譜表征方法，涵蓋了從糖鏈結(jié)構(gòu)分析、到糖基化位點(diǎn)鑒定、再到糖肽解析的完整分析流程。

　　寡糖鏈分析

單克隆抗體N-糖鏈 (a) LC-MS/MS完整分析流程, (b) IC-MS分析流程

ED安培檢測器和MS檢測N-糖型結(jié)果

　　使用賽默飛Vanguish Horizon UHPLC-FLD對人血清lgG和商業(yè)嵌合lgG1單抗(英夫利西單抗)中的n-聚糖進(jìn)行釋放、標(biāo)記、分離和基于外糖苷酶的結(jié)構(gòu)解析，并使用Q Exactive Plus超高分辨質(zhì)譜儀對結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)，實(shí)現(xiàn)快速和明確的分析。

在 Accucore 150-Amide-HILIC 上用不同長度的柱子對人血清 IgG 2-AB 標(biāo)記的N-聚糖進(jìn)行色譜分離

　　離子色譜無需衍生，定量準(zhǔn)確，可以覆蓋分析所有糖類型，N-糖基化修飾的糖鏈可以通過肽糖苷酶Ｆ或肽糖苷酶Ａ酶切作用，或者肼解作用從糖蛋白上釋放出來。糖鏈經(jīng)凈化后可直接進(jìn)樣，無需衍生，避免了衍生化過程中唾液酸化聚糖的結(jié)構(gòu)改變。

使用 Accucore 150-Amide-HILIC 色譜柱和 Q Exactive Plus 質(zhì)譜儀對人 IgG 中 2-AB 標(biāo)記的 N-聚糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定

　　離子色譜還可以和高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對色譜峰的鑒別。以Q Exactive為代表的Orbitrap超高分辨率質(zhì)譜對未標(biāo)記的糖具有高靈敏度，可解析糖鏈結(jié)構(gòu)。安培檢測器、高分辨質(zhì)譜和離子色譜聯(lián)用，可同時(shí)解決糖鏈的定性和定量分析。

Ofatumamab的N糖圖譜

　　糖基化位點(diǎn)分析

　　糖基化位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與確證對質(zhì)譜的分辨率與靈敏度具有較高要求。Orbitrap由于具有超高分辨率和超高靈敏度，無論對于單抗等純蛋白樣品、還是全細(xì)胞蛋白等復(fù)雜樣品，都是是糖基化位點(diǎn)表征的最佳工具。目前糖基化位點(diǎn)最大的數(shù)據(jù)集，共從小鼠組織與血漿中注釋了6367個(gè)糖基化位點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)采用用PNGase F釋放糖鏈并標(biāo)記18O方法，使用Orbitrap鑒定糖基化位點(diǎn)，共鑒定到6367個(gè)位13點(diǎn)，其中5753個(gè)位點(diǎn)是沒有記載的新位點(diǎn)。該研究對糖蛋白糖基化的研究具有重要意義，也展示出了Orbitrap超群的性能。在相對簡單的抗體及其他蛋白藥物糖基化位點(diǎn)表征中，Orbitrap 更可毫無疑問地勝任此工作。

　　對于糖結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)信息分析，Orbitrap Eclipse三合一質(zhì)譜儀擁有CID, HCD, ETD HD, EThcD HD, ETciD, UVPD, PTCR等多種碎裂模式，而且還具有高達(dá)50萬的分辨率，能夠?qū)Χ喾N形式的修飾肽段進(jìn)行精準(zhǔn)定性與定量，為研究者提供了更堅(jiān)實(shí)的硬件基礎(chǔ)。