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表面等離子共振分子互作BIACORE的原理

2021.10.13

首先先了解幾個術(shù)語和定義：

表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）

一、消逝波

當光從光密介質(zhì)入射到光疏介質(zhì)，入射角增加到某一角度，使折射角達到90°時，折射光將完全消失，而只剩下反射光，這種現(xiàn)象叫做全反射。

當以波動光學的角度來研究全反射時，人們發(fā)現(xiàn)當入射光到達界面時并不是直接產(chǎn)生反射光，而是先透過光疏介質(zhì)約一個波長的深度，再沿界面流動約半個波長再返回光密介質(zhì)。則透過光疏介質(zhì)的波被稱為消逝波。

如下圖所示。

全反射時如圖中所示沿X軸方向振幅衰減的一個波，即入射光波在反射面不立即消失，而是投射進入光疏介質(zhì)一定深度，且振幅在垂直方向呈指數(shù)衰減，這種電磁波叫消逝波。

二、等離子波

把金屬表面的價電子看成是均勻正電荷背景下運動的電子氣體，其中正、負帶電粒子數(shù)目幾乎相等，這實際上也是一種等離子體。當金屬受電磁干擾時，金屬內(nèi)部的電子密度分布會變得不均勻。因為庫侖力的存在，會將部分電子吸引到正電荷過剩的區(qū)域，被吸引的電子由于獲得動量，故不會在引力與斥力的平衡位置停下而向前運動一段距離，之后電子間存在的斥力會迫使已經(jīng)聚集起來的電子再次離開該區(qū)域。由此會形成一種整個電子系統(tǒng)的集體震蕩，而庫侖力的存在使得這種集體震蕩反復進行，進而形成的震蕩稱等離子震蕩，并以波的形式表現(xiàn)，稱為等離子波。

三、SPR光學原理

光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時，會形成消逝波進入到光疏介質(zhì)中，而在介質(zhì)中又存在一定的等離子波。當兩波相遇時可能會發(fā)生共振。當消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時，檢測到的反射光強會大幅度地減弱。能量從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子，入射光的大部分能量被表面等離子波吸收，使反射光的能量急劇減少。

可以從反射光強響應(yīng)曲線看到一個最小的尖峰，此時對應(yīng)的入射光波長為共振波長，使反射光完全消失的入射角就是SPR角。SPR角隨金膜表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金膜表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。因此可以通過對生物反應(yīng)過程中SPR角的動態(tài)變化獲取分子之間相互作用的特異信號。

SPR生物傳感器的光源為偏振光（polarized light），傳感芯片（sensor chip）表面鍍有一層金膜，實驗時，先將一種生物分子（ligand）固定在金膜表面，然后將與之相互作用的分子（analyte）溶于溶液（或混合液）流過芯片表面。SPR檢測器能跟蹤溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個過程的變化，不同角度的反射光的光強被記錄后得到角度-光強曲線圖，每條曲線的波谷即為該曲線的共振角，共振角對應(yīng)的角度為共振信號（resonance signal），時間與對應(yīng)共振信號的曲線即為SPR傳感圖（sensorgram）。

表面等離子共振生物分子相互作用分析儀（BIACORE）的原理

當一束光線通過棱鏡射向金屬表面，在金屬發(fā)生全反射現(xiàn)象時，會在金屬膜中產(chǎn)生消逝波，消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時，檢測到的反射光強會大幅度地減弱。此時對應(yīng)的入射光波長為共振波長，對應(yīng)的入射角為共振角，即SPR角。SPR角隨著金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。

Biacore的核心組件就是由微流路系統(tǒng)，光學組件及金膜芯片組成。金膜芯片上的蛋白和流路中的分子結(jié)合有解離的過程中，SPR角就會隨之發(fā)生變化，檢測器檢測到這種變化，根據(jù)此變化曲線作圖分析，可得出分子間的結(jié)合常數(shù)K_a、解離常數(shù)K_d或親和力常數(shù)K_D。

以免疫學分析為例，在金膜表面固定某種受體（如抗體）然后流過含相應(yīng)配體（如抗原）的樣品，配體與受體的結(jié)合將使金膜與溶液界面的折射率上升，從而導致共振角發(fā)生變化。為了表述的方便，共振角（或共振信號）可以用共振單位（resonance units，RU）來表示。對大多數(shù)生物分子而言，1000RU大約等于1mm²的面積上有1ng的質(zhì)量變化，相當于溶液中蛋白濃度為6mg/mL。SPR生物傳感器通過檢測獲得共振角的改變程度，便可以對配體濃度進行定量。

? SPR 是一種折光率傳感器，其響應(yīng)值反映了SPR角度的改變?

? 響應(yīng)信號依賴于芯片表面分子的濃度和溫度?

? 1 RU 的響應(yīng)值大致上相當于芯片表面結(jié)合物質(zhì)的濃度改變了1 pg/mm² (蛋白結(jié)合與CM5芯片)?

如下圖所示。

Biacore的核心組件包括：

SPR生物傳感技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域包括：生物大分子的相互作用；腫瘤研究；免疫學和傳染病；神經(jīng)科學；生物制藥；蛋白質(zhì)組學。

Biacore可研究的生物分子范圍包括：蛋白質(zhì)；DNA/RNA；脂類/脂質(zhì)體/生物膜；多糖；多肽；小分子；全細胞病毒/微生物。

可分析的對象：

Biacore核心組件

Biacore提供的生物分子相互作用信息包括：

有無結(jié)合（Yes or no）
結(jié)合的特異性和選擇性（Specificity）
兩種分子的結(jié)合強度-親和力（Affinity）
結(jié)合和解離的快慢和復合體的穩(wěn)定性-動力學（Kinetics）
功能復合體形成的參與者、協(xié)同者和組裝順序（Mechanism）
分子結(jié)合的溫度與熱力學特征（Thermodynamics）
目標分子活性含量的檢測（Concentration）

SPR光學組件

微流控系統(tǒng)(IFC)具有的特性包括：集成化、自動化的微流路控制系統(tǒng)；樣品消耗量低；為互相作用分析而設(shè)計優(yōu)化

微流控系統(tǒng)(IFC)-流動池的特點為：

IFC上有4個流動池；可選擇單獨、配對、串聯(lián)使用。流動池為配對使用進行了優(yōu)化（Fc1-Fc2，F(xiàn)c3-Fc4）

傳感芯片：

葡聚糖表面的特點：親水性；溫和型:和2%濃度的葡聚糖水溶液環(huán)境相似；非特異性結(jié)合量低；高結(jié)合容量；易于進行共價結(jié)合；出色的化學穩(wěn)定性。

傳感芯片的選擇：

11種不同的芯片種類

CM5，CM4，CM3：芯片、蛋白、肽段、小分子等
CM7：小分子化合物研究
SA芯片：生物素標記的分子，如核酸、糖類等
Biotin CAP芯片：可逆性生物素捕獲芯片心
NTA芯片：His重組蛋白
L1芯片：模擬脂質(zhì)雙分子層環(huán)境
HPA芯片：實現(xiàn)膜系統(tǒng)相關(guān)的互作分析
C1芯片：研究細胞、病毒等大顆粒分子
Au裸金芯片：客戶定制表面（材料、高分子等）

30余種不同的試劑盒及緩沖液產(chǎn)品：

氨基偶聯(lián)試劑盒、巰基偶聯(lián)試劑盒；
GST捕獲試劑盒 GST重組蛋白分析
NTA捕獲試劑盒 His重組蛋白分析?

最常用的傳感器芯片：

Biacore實驗的基本流程

分析物和配體的定義

芯片表面預處理 – 偶聯(lián)/固定配體 (Immobilization)?

–什么是固定配體？?

–將配體直接（共價）或者間接地 (通過捕獲分子) 固定于芯片表面；或稱為偶聯(lián)蛋白：在芯片表面偶聯(lián)分子Ligand或捕獲分子?

樣品進樣（Injection）的過程為：

分析物（Analyte）進樣后，以恒定的流速和濃度流過芯片表面
樣品中的待分析物與固定在芯片表面上的配體發(fā)生結(jié)合，芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量發(fā)生改變，儀器記錄下對應(yīng)的響應(yīng)值（response）的改變
進樣結(jié)束后，切換緩沖液流過芯片表面，分析物由配體上自發(fā)解離，解離的進程由響應(yīng)值實時監(jiān)控